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  • 成牙本质细胞内牙本质涎蛋白被活性明胶酶酶切的研究
  • 浏览 63 次 【字号 】 发布日期:[ 2020-6-10 ]

  • 【摘要】:牙本质涎磷蛋白(DSPP),由成牙本质细胞合成,合成后很快就被酶切为C端的牙本质磷蛋白(DPP)和N端的牙本质涎蛋白(DSP),且此酶切过程对其生物学功能的获得十分重要。牙本质涎蛋白,可被其他的蛋白酶进一步被酶切成小分子蛋白片段,并且其N端和C端片段在牙本质中的分布模式不同。在成牙本质细胞系MO6-G3的细胞裂解液中,不仅存在牙本质涎蛋白的全长形式,而且还有分子量处于25-65kDa之间的多种牙本质涎蛋白片段存在。明胶酶(包括基质金属蛋白酶9和2),属于基质金属蛋白酶家族,在许多生理和病理活动中发挥重要作用。以非活性酶原形式分泌到细胞外的明胶酶被其他蛋白酶激活后获得酶切活性,然后活性明胶酶通过降解某些细胞外基质成分来发挥作用。近来有文献报道,活性明胶酶能够酶切某些细胞内底物蛋白。那么,成牙本质细胞内内存在活性基质金属蛋白酶9(MMP9)的机制是什么?弗林蛋白酶(FURIN),前体蛋白转化酶家族的成员之一,广泛存在于包括成牙本质细胞在内的机体多种类型细胞内,在胚胎发育过程中作用十分关键。弗林蛋白酶可识别前体蛋白的(K/R)-(X)n-(K/R)_2(X是除精氨酸外的其他任何氨基酸,n=0,2,4,6)序列并酶切,从而通过激活或者失活下游的前体蛋白来发挥作用。对基质金属蛋白酶9(MMP9)的前体蛋白进行氨基酸序列分析后发现,在其前肽和活性酶结构域间存在着弗林蛋白酶的识别序列(K/R)-(X)n-(K/R)_2,且基质金属蛋白酶9与弗林蛋白酶在成牙本质细胞内存在相互结合。在此论文中,将会探索成牙本质细胞内牙本质涎蛋白被活性明胶酶酶切及成牙本质细胞内存在活性MMP9的机制。第一部分:成牙本质细胞内牙本质涎蛋白被活性明胶酶酶切的研究目的:证明在成牙本质细胞内,牙本质涎蛋白可被活性明胶酶酶切。材料与方法:1.取新生小鼠的磨牙牙乳头细胞培养,矿化诱导液诱导分化为成牙本质细胞。2.分离出生后1天、3天、7天小鼠下颌组织,固定、脱矿、石蜡包埋后切片。对小鼠下颌组织切片及爬片上生长的成牙本质细胞进行免疫荧光实验,确定牙本质涎蛋白和明胶酶在成牙本质细胞内的表达模式,以及探索二者是否在细胞内存在共定位。3.原位邻接技术检测成牙本质细胞内牙本质涎蛋白和明胶酶的结合情况。4.明胶酶谱实验和原位明胶酶谱实验检测成牙本质细胞内明胶酶的表达情况。5.将生长密度相同的成牙本质细胞随机分成四组,在各组培养液中分别加入DMSO、MMP9抑制剂、基质金属蛋白酶2(MMP2)抑制剂及广谱基质金属蛋白酶抑制剂,置于培养箱中培养8h。相同生长密度的Mmp9-/-小鼠成牙本质细胞在相同条件下培养相同时间,然后分别收集以上各组细胞的胞内总蛋白,Western Blot技术检测成牙本质细胞内牙本质涎蛋白的表达变化。结果:1.在小鼠下颌组织中,明胶酶广泛表达于成牙本质细胞层,牙乳头细胞及周围的牙槽骨中。2.牙本质涎蛋白分别与MMP9或MMP2在成牙本质细胞内存在共定位。3.成牙本质细胞内,牙本质涎蛋白与明胶酶存在结合。4.成牙本质细胞内有明胶酶表达,且细胞内的明胶酶有活性蛋白酶和非活性酶原两种形式。5.培养液中加入不同抑制剂培养后,成牙本质细胞内的牙本质涎蛋白表达模式不同。在Mmp9-/-小鼠的成牙本质细胞内,以及加入MMP9抑制剂、MMP2抑制剂、广谱基质金属蛋白酶抑制剂培养的野生型小鼠的成牙本质细胞内,高分子量(100kDa)牙本质涎蛋白的含量增加,且高分子量DSP蛋白(100kDa)/低分子量蛋白(100kDa)的比值明显高于DMSO处理的的成牙本质细胞组。结论:成牙本质细胞内存在活性的MMP9和MMP2蛋白酶,且二者参与了成牙本质细胞内牙本质涎蛋白的酶切。第二部分:成牙本质细胞内存在活性MMP9的机制初步探究目的:探究成牙本质细胞内存在活性基质金属蛋白酶9的机制材料与方法:1.免疫组化实验检测弗林蛋白酶(FURIN)在出生后1天和7天小鼠磨牙组织中的表达情况。2.免疫荧光实验检测成牙本质细胞内FURIN与MMP9的共定位情况。3.免疫共沉淀实验检测成牙本质细胞内FURIN与MMP9的结合情况。4.将RVKR抑制剂加入至培养基中,用于抑制成牙本质细胞内的FURIN活性,Western Blot实验检测成牙本质细胞内MMP9的变化情况。结果:1.FURIN恒定广泛的表达于成牙本质细胞层、牙囊细胞、牙乳头细胞及周围的牙槽骨中,但其在成牙本质细胞内的表达水平高于其他部位。2.成牙本质细胞内,FURIN与MMP9的表达部位存在重合。3.成牙本质细胞内,FURIN与MMP9存在结合。4.RVKR抑制FURIN活性后,成牙本质细胞内活性MMP9蛋白酶的表达量降低,且MMP9酶原/活性MMP9蛋白酶的比值增加。结论:FURIN参与了成牙本质细胞内MMP9酶原的活化
    【分类号】:R78
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